Quatre fois plus rapide que les méthodes PCR conventionnelles, la nouvelle approche RADICA est hautement spécifique, sensible et résistante aux inhibiteurs.
Des chercheurs de Analyse critique pour la fabrication de médecine personnalisée (CAMP), un groupe de recherche interdisciplinaire au Alliance Singapour-MIT pour la recherche et la technologie (SMART), l’entreprise de recherche du MIT à Singapour, a développé une nouvelle méthode de détection rapide et précise des acides nucléiques viraux – une percée qui peut être facilement adaptée pour détecter différentes cibles d’ADN/ARN dans des virus comme le coronavirus.
Coronavirus. Crédit : Pete Linforth sur Pixabay, licence gratuite
La pandémie a mis en évidence l’importance de diagnostics rapides et de méthodes améliorées pour détecter les virus, d’autant plus que le monde cherche à se préparer aux futures pandémies ou au prochain agent pathogène dangereux. En particulier, l’industrie de la bioproduction, confrontée aux défis uniques de l’utilisation des cellules comme produits de thérapie cellulaire, recherche des innovations dans les méthodes rapides pour détecter la contamination virale dans le cadre de leurs processus de contrôle qualité et des tests de libération.
Bien que la réaction en chaîne par polymérase quantitative de transcription inverse (RT-qPCR) soit considérée comme un étalon-or pour la détection virale, il existe des limites et elles peuvent souvent produire des résultats variables.
Après extraction d’ADN/ARN, des échantillons peuvent être utilisés pour la détection et la quantification de diverses cibles. La réaction RPA-Cas12a dans chaque partition positive amplifie de manière exponentielle l’ADN cible, déclenchant davantage d’activation de Cas12a et augmentant la lecture de fluorescence. De cette manière, le temps de réaction de RADICA est réduit de quatre fois (de quatre heures à une heure, par rapport à la dPCR). Crédit image : SMART
Une version plus précise est la méthode PCR numérique qui permet une quantification absolue (ce qui signifie qu’elle révèle le nombre de copies de virus dans un échantillon), peut permettre de définir des seuils clairs de contamination virale et n’est pas sensible aux fluctuations potentielles du gène de référence requis par la qPCR standard. méthodes. Cependant, la PCR numérique demande un temps de réaction relativement long d’environ quatre heures. Un autre inconvénient de toutes les méthodes actuelles basées sur la PCR est qu’elles nécessitent un équipement coûteux pour un contrôle et un cycle précis de la température.
Le nouveau développement méthodologique de CAMP — l’approche RAPid Digital Crispr (RADICA) — permet une quantification absolue des acides nucléiques viraux en 40-60 minutes de manière isotherme dans un bain-marie, un équipement de laboratoire prototype et peu coûteux. Les recherches de l’équipe sont expliquées dans un article intitulé « Méthode numérique basée sur CRISPR pour la détection rapide et la quantification absolue des acides nucléiques» publié récemment dans la revue Biomatériaux.
La méthode RADICA a été testée sur l’ADN/ARN synthétique du SRAS-CoV-2 ainsi que sur le virus d’Epstein-Barr dans des cellules B cultivées et du sérum de patient. Les chercheurs affirment que la méthode peut être adaptée pour détecter d’autres types de virus et dans d’autres types d’échantillons tels que la salive et les milieux de culture cellulaire. RADICA est également capable de distinguer les virus de leurs proches parents.
« Il s’agit de la première méthode signalée de détection d’acides nucléiques à utiliser la sensibilité de l’amplification isotherme et la spécificité de la détection basée sur CRISPR dans un format numérique – permettant une amplification rapide et spécifique de l’ADN sans le besoin long et coûteux d’un cycle thermique » explique Xiaolin Wu, post-doctorante au SMART CAMP. « RADICA offre une quantification absolue quatre fois plus rapide que les méthodes PCR numériques conventionnelles. »
L’équipe utilise l’ADN/ARN extrait de l’échantillon et divise une réaction de 15 microlitres en milliers de partitions indépendantes. Dans chaque partition, l’ADN/ARN est amplifié et identifié par la protéine Cas12a, une enzyme qui peut transformer le signal cible en un signal fluorescent. Cela permet d’obtenir une quantification absolue en comptant le nombre de partitions qui ont l’ADN/ARN cible et qui sont allumées.
« L’année dernière nous a montré l’importance de détecter les virus rapidement et avec précision, et RADICA peut aider à combler les lacunes existantes dans ce domaine », déclare Hanry Yu, professeur à l’Université nationale de Singapour, co-auteur et co-chercheur principal au SMART CAMP. . « Les produits de thérapie cellulaire ont une durée de vie très courte et les patients ont généralement besoin d’un traitement de toute urgence. Les tests de stérilité actuels nécessitent environ 14 jours, ce qui est trop lent pour les besoins cliniques, mais RADICA raccourcit le processus en heures.
Timothy Lu, auteur co-correspondant, chercheur principal du CAMP et professeur agrégé de génie biologique, de génie électrique et d’informatique au MIT, affirme que la méthode de l’équipe est plus rapide, moins chère et plus efficace que ce qui est utilisé aujourd’hui, et son format le rend plus tolérant à la contamination ou aux inhibiteurs qui peuvent être présents dans les échantillons biologiques – souvent le cas avec les produits de thérapie cellulaire. Lu ajoute qu’en plus de détecter la présence d’un virus cible, RADICA identifie également le nombre de virus présents dans l’échantillon, ce qui peut aider les médecins et les chercheurs à décider du déroulement du traitement, ainsi que la production et la gestion des stocks de produits de thérapie cellulaire. .
Alors que les chercheurs du CAMP ont développé RADICA pour surveiller les processus de fabrication de thérapie cellulaire et les tests de libération de biosécurité des produits de thérapie cellulaire, Wu dit que la méthode peut également être utilisée pour détecter les cibles ADN/ARN de différents virus et adaptée aux dispositifs couramment trouvés dans les hôpitaux et les laboratoires de service. — fournir une nouvelle façon potentielle de lutter contre les pandémies.
La recherche est menée par SMART et soutenue par la National Research Foundation (NRF) de Singapour dans le cadre de son programme Campus for Research Excellence And Technological Enterprise (CREATE).
Le CAMP a été lancé en juin 2019. Il se concentre sur de meilleures façons de produire des cellules vivantes en tant que médicaments ou thérapies cellulaires, afin de permettre à un plus grand nombre de patients d’accéder à des thérapies prometteuses et approuvées. Les chercheurs du CAMP s’attaquent à deux principaux goulots d’étranglement auxquels est confrontée la production d’une gamme de thérapies cellulaires potentielles : les attributs de qualité critiques (CQA) et les technologies d’analyse de processus (PAT). S’appuyant sur des collaborations approfondies au sein de Singapour et du MIT, CAMP invente et démontre les capacités CQA/PAT des cellules souches aux cellules immunitaires. Ses travaux portent sur des maladies allant du cancer à la dégénérescence tissulaire, ciblant les cellules adhérentes et en suspension, avec et sans génie génétique.
Écrit par l’Alliance Singapour-MIT pour la recherche et la technologie
La source: Massachusetts Institute of Technology
